Bokt.nl

**Geplaatst door de TopicStarter** : 15-01-18 15:29

HELP ijklijn!

Geplaatst door de TopicStarter : 15-01-18 15:29

First of all, ik heb enkele dingen al zelf geprobeerd maar ik heb het gevoel dat ik wat over het hoofd zie dus ik zie graag input van anderen.

Op school ga ik morgen een ELISA uitvoeren (voor de MLO/HLO-ers onder ons). Als oefenopgave hebben we een ijklijn met bekende extincties en concentraties gemaakt. Echter het probleem hier is niet het maken van de ijklijn, dat kan ik wel. Maar, ik weet bijna zeker dat het mogelijk is om deze punten ook lineair weer te geven. We mogen namelijk kiezen uit een logaritmische schaal en een lineaire schaal. Op onderstaande foto heb ik log van alle concentraties genomen en deze uitgezet tegenover de OD. Wanneer ik niet de log neem van de concentraties maar gewoon de concentraties uit zet tegenover de OD krijg een vreemd resultaat. Hoe krijg ik hier nou een rechte lijn uit? Ik hoop dat dit een beetje logisch klinkt? Zo nee, vraag gerust

In case iemand de waarden wil gebruiken om te helpen:

Afbeelding

**Geplaatst door de TopicStarter** : 15-01-18 15:32

Re: HELP ijklijn!

Geplaatst door de TopicStarter : 15-01-18 15:32

De foto's zijn een beetje groot

**Geplaatst**: 15-01-18 22:07

Geplaatst: 15-01-18 22:07

Ik ben totaal niet thuis in de materie, maar ik weet wel iets van dataverwerking en het lijkt me dat je met deze data geen lineair verband gaat krijgen. Hieronder het resultaat met beide assen logaritmisch, daar zit nog soort van lineair regiem in (met veel fantasie), maar het is duidelijk dat de bovenkant afvlakt.
Afbeelding

De fit die ik hier heb gemaakt is van de vorm c*(1-exp(-a*x)), die komt aardig in de buurt, dat krijg je niet zomaar lineair met je assen.

Ben je misschien te ver doorgegaan met ijken? Zoals ik al zei heb ik inhoudelijk geen verstand van het experiment, maar ik kan me voorstellen dat de extinctie een bepaald maximum bereikt boven een zekere concentratie? Dan zou je die natuurlijk niet mee moeten nemen in je ijkgrafiek.

Misschien praat ik nu complete onzin hoor maar ik vind het wel interessant

Laat je even weten wat het probleem uiteindelijk was?

**Geplaatst**: 18-01-18 21:38

Re: HELP ijklijn!

Geplaatst: 18-01-18 21:38

Je hoogste concentraties hebben een gelijke OD waarde. Wat het eerste in mij opkomt is een beperking in je spectrofotometer? Met de getallen die je nu hebt uitgezet ga je geen lineare lijn krijgen maar dan vlakt ie idd af zoals hierboven te zien.

**Geplaatst**: 19-01-18 11:10

Re: HELP ijklijn!

Geplaatst: 19-01-18 11:10

Ben je er inmiddels uit? Aan de vorm van de curce in je startpost in combinatie met ELISA en concentraties te zien zal het hier om een dosis effect curve gaan (dosis response). Er is in Excel een methode om hier mee te rekenen in de Analysis Toolpack, maar ben mijn hoofd aan het breken hoe het ook alweer ging....

**Geplaatst**: 19-01-18 11:51

Re: HELP ijklijn!

Geplaatst: 19-01-18 11:51

De hoogste 2 concentraties moeten er sowieso uit, hier zit je namelijk op je uiterste meetbereik van de apparatuur en deze waardes zeggen dus helemaal niet. Ze hadden immers ook veel hoger kunnen zijn waardoor je wel op een rechte lijn uit was gekomen.
Bij de concentratie van 2000 pg/ml zie je het begin van het meet plateau ontstaan, waarschijnlijk is de spectrometer waarmee je gemeten hebt oud dus dan zou het me niets verbazen als deze waarde niet helemaal juist is. Wanneer dit punt erin blijft staan krijg je een lineaire trend van r^2 0,74 dus dat is niet ideaal.
Wanneer je dit punt eruit haalt (dus 800 pg/ml als hoogste) hou je een lineaire trend met R^2 van 0,90 over. Dit is dus duidelijk een lineair verband maar voor je ijklijn wil je liever hoger zitten met deze waarde (0,99 het liefst).
Je zou zelf nog kunnen kijken wat er gebeurt als je punten weghaalt/ laat staan. Zolang je de reeks maar niet onderbreekt mag je waardes weghalen uit je ijklijn. Hierdoor zullen de extincties van je samples die buiten de ijklijn vallen echter niet meer betrouwbaar zijn.

Overigens reken is zelf nooit met concentraties in een log schaal wanneer ik ijklijnen maak, dit zou ik alleen doen voor dose-effect curves om EC50 waardes mee te kunnen bereken.

Je gekke resultaat valt dus opzich wel mee, je was tijdens het meten gewoon gelimiteerd met de maximale extinctie van je apparatuur.

Overigens een tip voor volgende keer, meet je ijklijn in duplo. Dat geeft vaak betere ijklijnen.